TIRFM(Total Internal Reflection Fluorescence Microscope)，全內(nèi)反射熒光顯微鏡，利用光從高折射率的介質(zhì)進(jìn)入較低折射率的介質(zhì)時(shí)，如果入射角足夠大時(shí)則光全部被反射而不發(fā)生折射，但是在兩種介質(zhì)的界面會(huì)產(chǎn)生衰逝波可以激發(fā)近界面100nm范圍內(nèi)的熒光的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)物體表面的觀察。可通過(guò)常規(guī)熒光顯微鏡的照明器或特殊照明器送入激發(fā)光，并對(duì)激光的入射角度進(jìn)行控制，采用瞬間場(chǎng)激發(fā)方法以避免激發(fā)光進(jìn)入探測(cè)器，在玻璃和水界面的激發(fā)光產(chǎn)生全內(nèi)反射實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)榧ぐl(fā)光呈指數(shù)衰減的特性，只有極靠近全反射面的樣本區(qū)域會(huì)產(chǎn)生熒光反射，大大降低了背景光噪聲干擾觀測(cè)標(biāo)的，故此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面物質(zhì)的動(dòng)態(tài)觀察。
 

全內(nèi)反射熒光顯微鏡 (TIRFM)示意圖
 

　　①樣品 ②損耗波范圍 ③蓋玻片 ④浸鏡油 ⑤目標(biāo) ⑥發(fā)射光束(信號(hào)) ⑦激發(fā)光束
 

　　為了實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。這可以通過(guò)棱鏡(prism)實(shí)現(xiàn)，稱(chēng)為棱鏡型TIRFM(prism-based TIRFM)，也可通過(guò)高數(shù)值孔徑的物鏡實(shí)現(xiàn)，此時(shí)稱(chēng)為物鏡型TIRFM(objective-type TIRFM)。現(xiàn)在商品化的全內(nèi)反射熒光顯微鏡一般都是物鏡類(lèi)型的，速度快，精度高。
 

　　全內(nèi)反射熒光顯微鏡由于能實(shí)現(xiàn)物體表面非常薄范圍內(nèi)(小于100nm)熒光觀察，故在某些生物領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。如以下等應(yīng)用：
 

　　細(xì)胞表面圖象的觀察：細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)、細(xì)胞表層的接觸、膜表面動(dòng)力學(xué)/蛋白質(zhì)定位。
 

　　單分子觀察及其操作：肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白與Cy3標(biāo)記ATP。
 

　　細(xì)胞膜表面運(yùn)動(dòng)：如泡吞、泡吐現(xiàn)象，泡外分泌現(xiàn)象。
 

　　細(xì)胞膜鈣火花現(xiàn)象的觀察，離子通道監(jiān)視。
 

　　分子馬達(dá)研究：旋轉(zhuǎn)的馬達(dá)、細(xì)胞骨架蛋白、聚合體、G蛋白、環(huán)狀蛋白、核苷酸馬達(dá)。
 

　　除了在生物領(lǐng)域外，在化學(xué)領(lǐng)域等對(duì)于化學(xué)分子結(jié)構(gòu)觀察中也有很好的應(yīng)用。